Флуоресценция и мониторинг фитопланктона

Электронное методическое пособие по некоторым флуоресцентным методам

Перед экологами современности встает множество задач, касающихся мониторинга различных водоемов, от прудов до океанов. И в этом деле много внимания уделяют фитопланктону - первичному звену трофической цепи гидроэкосистемы. Что же именно интересует исследователей микроводорослей? В первую очередь - их численность, которую можно определить через количество фотосинтезируюшего пигмента - хлорофилла, способного переизлучать поглощенную энергию света, то есть флуоресцировать. Измеряя флуоресценцию фитопланктона, можно рассчитать концентрацию хлорофилла у микроводорослей трех основных таксонов: сине-зеленых, диатомовых и зеленых, обладающих различиями пигментного аппарата и спектров возбуждения флуоресценции.

Использование флуоресцентных методов

Методы исследования фитопланктона, основанные на измерении флуоресценции, разработаны и используются в Красноярском государственном университете, на кафедре физиологии и микробиологии.
Измерения проводятся как в лаборатории, на экспериментальных культурах водорослей, так и на водоемах, в полевых условиях.

Флуоресценция, её природа и свойства

Биофизический механизм флуоресценции

Первичным актом запасания энергии при фотосинтезе является поглощение света молекулами пигментов. При этом молекула переходит из основного (невозбужденного) в возбужденное состояние (S*). По существу, это означает переброс одного из двух p-электронов с низкой энергетической орбиты на более высокую без изменения спина. Наличие в спектре поглощения хлорофилла двух главных пиков говорит о том, что существует два наиболее вероятных для данной молекулы синглетных уровня: более высокий (S*2) при поглощении синего света и более низкий (S*1) при поглощении красного.
Каждый поглощенный молекулой хлорофилла квант красного света переводит электрон из основного состояния в возбужденное, причем вся энергия кванта поглощается в этом процессе электроном. Поглощение кванта синего света переводит электрон в еще более возбужденное состояние, однако, попав на более высокий энергетический уровень, электрон тотчас же падает обратно на «красную» орбиту, причем слишком быстро, чтобы совершить при этом какую-либо полезную химическую работу .
Одним из путей дезактивации возбуждения является эмиссия света, называемая флуоресценцией. Она представляет собой энергию, испускаемую в виде электромагнитного излучения при переходе молекулы возбужденного синглетного состояния в основное. Время жизни при флуоресценции для большинства органических молекул лежит в пределах от 10-9 до 10-6 с..
Так как флуоресценция является следствием перехода с нижнего энергетического уровня и подуровня, то спектр флуоресценции практически не зависит от длины волны возбуждающего света и всегда смещен в более длинноволновую область по отношению к красному пику поглощения. 

Поглощение света пигментами

В живых растениях (in situ) первоначально свет поглощается пигментами, входящими в крупные пигмент-белковые комплексы: светособирающий комплекс (ССК) и комплексы фотосистем 2 и 1 (ФС-2, ФС-1). Основная функция ССК - „светосбор" и передача поглощенной энергии на комплексы ФС-2 и ФС-1. Последние наряду с функцией светосбора за счет набора пигментов в антенной части комплекса обеспечивают с участием соответствующих реакционных центров Р680 и Р700 первичный акт разделения заряда, являющегося начальным этапом трансформации световой энергии в энергию химических связей первичных продуктов фотосинтеза.
Поглощенная светособирающим комплексом и антеннами ФС-2 и ФС-1 световая энергия распределяется по трем основным каналам: температурная дезактивация, быстрая флуоресценция и фотохимические реакции.
Высокая скорость фотохимических реакций при малом числе реакционных центров (1—3 % от общего хлорофилла а) обеспечивается системой „фокусировки" (внутри- и межкомплексная миграция энергии), за счет которой диффузионный поглощенный свет концентрируется в реакционные центры ФС-2 и ФС-1. Строго направленный поток энергии от пигментов-сборщиков в реакционные центры осуществляется за счет реализации общего принципа: передача энергии идет от коротковолновых форм пигментов к длинноволновым (в пределах комплекса) и от комплексов с коротковолновыми к комплексам с длинноволновыми формами пигментов.
Межкомплексная передача энергии является, по-видимому, одним из основных лимитирующих и, следовательно, активно регулируемым звеном в общей системе регуляции фотосинтеза. Поэтому не случайно при изучении систем регуляции выхода флуоресценции особое внимание уделяется межкомплексному взаимодействию.
Эффективность межпигментной и межкомплексной передачи энергии зависит от природы пигментов, структурной организации фотосинтетического аппарата, условий среды. Высокая эффективность миграции энергии, структура энергетических уровней каротиноидов и ксантофиллов приводят к тому, что при обычных условиях окружающей среды дополнительные пигменты, за исключением фикобилипротеинов, в естественных системах не флуоресцируют. Способностью к флуоресценции обладают молекулы хлорофилла а, входящие в состав ССК антенны ФСII (максимум флуоресценции на волне 665 нм). 

Особенности флуоресцентции пигментов

Свойство хлорофилла a и его предшественников к флуоресцентной эмиссии позволяет идентифицировать эти зеленые пигменты и охарактеризовать их в комплексной среде. Флуоресцентный метод может существенно помочь в определении и быстрой характеристике флуоресцирующих пигментов (таких, как хлорофиллы) среди нефлуоресцирующих (каротиноиды) без какого-либо разделения на компоненты. Флуоресценция также испускается фикоцианинами и фикоэритринами. Очень слабая флуоресценция была приписана каротиноидам in vitro.
Молекула пигмента, для излучения максимального сигнала флуоресценции, полностью возбуждена излучением, которое поглощается в наибольшей степени: хлорофиллы, которые имеют две полосы поглощения, обычно облучались синим светом (так как возбуждение красной областью спектра будет смешиваться со слишком близкими полосами эмиссии). Интенсивность флуоресценции определяется температурой , pH и находится под значительным влиянием процессов траспорта энергии и примесей, особенно неорганических ионов. 

Спектр флуоресценции

Обозначения: Зеленым цветом обозначен спектр поглощения хлорофилла, а красным- спектр флуоресценции.

Свойства спектров

Максимумы поглощения хлофилла находится в красной и сине-фиолетовой области спектра, а флуоресценция происходит лишь в красной. Это связано с электронными переходами. Её спектральная линия как бы зеркально перевернута и сдвинута в длинноволновую сторону.

Фитопланктон и экологический мониторинг

Флуоресцентный метод в исследованиях альгоценозов

Флуоресцентный метод, от большинства стандартных гидробиологических методов исследования отличается более высокой точностью и меньшей трудоемкостью, что позволяет уменьшить время обработки пробы фитопланктона. Это предоставляет возможность проводить экспресс-анализ состояния водных экосистем, создавая большие массивы данных для проведения систематических исследований в течении многих лет. Объектами исследования, кроме экстракта пигментов, служат живые клетки водорослей (in vivo), что позволяет судить о физиологическом состоянии фитопланктона, важнейшего звена в природных экосистемах.
Флуоресцентные методы позволяют работать с нативными объектами, поскольку при низких интенсивностях свет, возбуждающий флуоресценцию, мало меняет физиологическое состояние тканей, эти методы практически безынерционны, обладают относительно высокой чувствительностью и обеспечивают регистрацию динамики процессов .
Таким образом, явление флуоресценции, благодаря своим свойствам, широко применяется для исследования фотосинтетических пигментов растений и физиологических процессов.

Фитопланктон в гидроэкосистемах

Как известно, водоросли ассимилируют солнечную энергию, накапливая ее в форме органических соединений в процессе фотосинтеза, при этом выделяют кислород, необходимый для дыхания и самих водорослей, и всех остальных обитателей водоема. А синтезированная органика служит источником энергии гетеротрофным организмам - бактериям, животным и т.д. И поэтому, свойства фитопланктонного звена экосистемы определяет её состояние. Численность, биомасса, таксономический состав, физиологическая активность фитопланктона позволяют сделать выводы о благополучии водоёма или его кризисном состоянии.

Особенности пигментного аппарата и динамика фитопланктона

Наряду с общей универсальностью организации пигмент- белковых комплексов фотосинтезирующих организмов существует и определенная специфичность: наиболее вариабельным по количественному и качественному составу пигментов является свето-собирающий комплекс (ССК). У зеленых и эвгленовых водорослей ССК включает основное количество хлорофилла b, коротковолновые формы хлорофилла а и каротиноиды; у диатомовых — хлорофилл-а/с белковый комплекс, водорастворимый фукоксантин; у сине-зеленых — фикобилипротеины (фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин). В пределах каждой группы качественный состав пигментов генетически детерминирован, а количественное соотношение зависит от условий роста и развития водорослей (световой режим, содержание биогенных веществ и т. п.). В связи с этим существуют и специфические для основных таксонов водорослей различия в фотохимических процессах и транспорте энергии.
Состав, обилие и распространение фитопланктона по акватории водохранилища обусловленны неодинаковыми метеорологическими, гидрологическими условиями и антропогенным воздействием.
Cезонная динамика фитопланктона определяется совокупностью климатических условий: зимний планктон количественно и качественно беден, это обусловленно значительной толщиной льда и большой заснеженностью. Весной после вскрытия водохранилища (май - июнь) в планктоне увеличивается видовое разнообразие и его обилие, с преобладанием зеленых водорослей. Перемешивание водных масс и повышенная плотность воды весной обеспечивают интенсивное развитие водорослей в толще воды. С повышением температуры начинают вегетацию водоросли других отделов, которые образуют в верхних слоях воды повышенные концентрации; диатомеи скапливаются в придонных горизонтах. Вынос фитопланктона из зоны фотосинтеза снижает интенсивность его развития.
С глубиной уменьшается проникновение длинноволнового света, происходит развитие комплементарной пигментной адаптации в разных условиях освещенности. Это определяется изменениями в синтезе пигментов (фикобилипротеинов у сине-зеленых).
У цианобактерий синтез пигментов и других компонентов фотосинтезирующего аппарата конститутивен, но многие штаммы реагируют на цвет освещения, эта реакция носит название комплементарной хроматической адаптации. Если такие штаммы выращивают при зеленом свете, у них оказывается повышенное содержание фикоэритрина по отношению к фикоцианину, а если их выращивают при красном свете, они синтезируют очень незначительные количества фикоэритрина. Такие специфические изменения в содержании фикобилипротеидов, индуцированные освещением, позволяют клеткам наиболее эффективно поглощать свет той длины волны, которой их освещают.
Сезонная динамика хлорофилла с совпадает с динамикой хлорофилла а. Максимумы наблюдаются в конце апреля и в конце августа. Отношение Хл с/ Хл а, по мнению многих исследователей, является показателем физиологического состояния водорослей, увеличиваясь в “стареющем” планктоне и детритном материале. Увеличение отношения связанно с тем, что хлорофилл а разлагается быстрее, чем хлорофилл с. Отношение Хл с/ Хл а было наименьшим во время весеннего максимума хлорофилла а, а наибольшим - в январе-марте, когда световые условия наиболее неблагоприятны. По-видимому, это отношение действительно дает представление о физиологическом состоянии водорослей, так как при массовых вспышках их развития оно снижается, а в периоды между вспышками, когда часть водорослей уже отмерла, - повышается.
Таким образом, на формирование альгоценоза оказывают влияние многие факторы - сезонные изменения температуры и освещенности, глубина обитания, гидрологический режим и связанные с ним миграции водорослей, как вертикальные, так и по акватории водохранилища, а также влияние антропогенных факторов.

Прибор для измерения флуоресценции

Схема флуориметра 

1- корпус;
2- отделение для светофильтров, вырезающих область флуоресценции;
3,8- светофильтры;
4- шторка;
5- кювета;
6- магнитная мешалка;
7- держатель кюветы;
9- отделение для дополнительных светофильтров;
10- револьверная система смены светофильтров;
11- источник света(галогенная лампа);
12- фотоэлектронный умножитель.

Отбор проб
 
Пробы воды отбираются батометром с разной глубины, некоторая часть воды фильтруется, для измерения фонового сигнала флуоресценции (за счет органики и минеральных компонентов).
С поверхности пробы обычно отбираются ведром.